【Sci Adv.】北京大学万有/伊鸣教授团队借助CRISPR-SaCas9系统精准“删除”动物特定记忆

在已知宇宙中，脑可能是最复杂的物体之一，我们的脑大约有数百种不同类型的神经元，具有不同的形态、功能和遗传特征，它们之间通过突触形成联系，组成复杂的神经网络，其连接数目极其庞大，连接方式极为精密。不同神经环路中不同类型的神经元经过一定的整合，从而可以行使各种各样不同的功能，包括认知、记忆、运动等活动。为了理解大脑如何行使这些复杂的功能，我们需要使用精细的技术手段对特定的神经环路或特定的神经元进行操控。

记忆一直是个古老的谜题，研究发现，大脑内的印记细胞（engram cells）集合可以对记忆进行编码、储存和提取。不同的记忆由不同的印记细胞集合负责。然而要验证某类特定的神经元如何存储和读取特定的信息，难度很大。

基因编辑技术--CRISPR-Cas9系统能够快速、高效、方便地修饰不同细胞类型中的内源性基因。然而，在神经系统中应用CRISPR-Cas9系统存在两个障碍：其一，腺相关病毒载体（AAV）作为最常用的载体之一，其容量有限，因此，广泛使用的来自化脓链球菌的Cas9酶（SpCas9）会受到AAV病毒载体的容量限制，基于此，科学家们找到了来自金黄色葡萄球菌的Cas9酶（SaCas9），它比SpCas9小约1kb（使其能够更有效地包装进AAV载体中），但基因编辑的效率却基本一样。其二，由于神经网络的复杂性，要在具有特定连接或功能特征的神经元亚群中进行精准、稳定的基因操作仍然具有挑战性。

2020年3月18日，北京大学神经科学研究所万有与伊鸣团队在《Science Advances》发表最新研究工作[1]，该研究基于CRISPR-SaCas9系统，结合AAV病毒载体和活动依赖性细胞标记技术，实现了对大鼠大脑中通路特异性和功能特异性神经环路及神经元亚群的基因编辑，精确操控特定记忆的储存和消退，为解析大脑的高级认知功能提供了有力的策略。

结果

CRISPR-SaCas9系统在体外可高效地敲低CBP蛋白表达

首先，为验证体外CRISPR-SaCas9基因编辑效率，作者以cbp（CREB-binding protein, CREB结合蛋白）为靶基因，借助慢病毒载体将SaCas9和gRNA（Lenti-CMV-SaCas9-P2A-mCherry-U6-gRNA）转染到大鼠脑胶质瘤细胞系中（图1A,B），病毒表达三天后，通过免疫荧光、免疫印迹、Western blot以及T7核酸内切酶实验检测SaCas9表达情况及其体外基因编辑效率，结果显示SaCas9可高效地敲低CBP蛋白的表达（图1）。

图1体外验证SaCas9可高效地敲低CBP蛋白的表达

借助CRISPR-SaCas9系统可特异性敲除dCA1-PL通路上的cbp基因

有了体外数据，作者随后进行在体实验：特异性敲低接受背侧海马CA1亚区（dCA1）投射的前边缘皮层（PL）神经元中的cbp基因。

为验证dCA1-PL的直接投射通路，研究人员将顺行跨突触病毒载体（AAV1-CaMKII-Cre-P2A-GFP）注射dCA1，同时在PL区注射AAV9-hSyn-DIO-mCherry（图2A），病毒表达四周后，观察发现PL区有大量mCherry表达（图2B）。此外，借助逆行病毒载体rAAV2/retro做进一步验证：rAAV2/retro-hSyn-Cre注射PL区，AAV9-hSyn-DIO-mCherry注射dCA1，检测发现dCA1有大量mCherry表达（图2C,D）。

以上，作者分别借助顺行跨突触病毒载体（rAAV2/1）和逆行病毒载体（rAAV2/retro）验证了PL接受dCA1的直接投射。

为特异性敲除dCA1-PL通路上的cbp基因，研究人员将AAV1-CaMKII-Cre注射海马dCA1区，AAV9-hSyn-DIO-SaCas9和AAV9-U6-gRNA-mix-CMV-GFP以1:1的比例混合注射PL区（图2E），结果发现CBP蛋白表达显著降低（图2F-I）。此外，免疫荧光和电生理结果显示，敲低cbp后，神经元PSD-95（突触后致密蛋白-95，神经元可塑性marker）、gRNA阳性神经元树突棘密度均显著下降（图2J-M）。同时，全细胞膜片钳结果显示，敲低cbp基因可有效降低神经元的兴奋性（图2N,O）。

图2  借助CRISPR-SaCas9系统可特异性敲除dCA1-PL通路上的cbp基因

借助CRISPR-SaCas9系统特异性敲低dCA1-PL通路上突触后印记细胞群中cbp基因，导致大鼠远期记忆受损

有研发报道，在PL区有小部分印记细胞群（engram cells）编码远期记忆[2,3]。基于上述结果，研究人员借助CRISPR-SaCas9系统特异性操纵PL印记细胞群中的cbp基因。他们在PL注射AAV9–cfos–rtTA-U6-gRNA和AAV9-TRE3G-SaCas9病毒（图3A）。

该系统直接将即刻早基因c-fos的标记体系和Doxycycline（Dox）诱导的Tet-on系统结合，在此套系统中，基因的表达需要rtTA与TRE启动子结合，然而生理条件下，rtTA不结合到TRE，从而阻止了SaCas9的表达，只有在给予动物Dox药物之后，Dox与rtTA结合的复合体启动SaCas9表达在c-fos阳性的PL神经元，从而做到特异性敲除cbp基因。

随后，借助基因编辑技术与活动依赖性细胞标记技术，作者进行情景恐惧（contextual fear conditioning，CFC）行为学试验（图3B）。结果发现，SaCas9特异性表达在与恐惧训练相关的PL神经元上，同时，特异性敲低PL神经元cbp基因后，大鼠的木僵行为（freezing，老鼠的一种防御反应）降低（图3C-F）。

此外，研究人员验证了活动依赖性细胞标记技术是否具有环境特异性，在A、B两个实验箱中对大鼠进行恐惧记忆训练，训练两周后，给予B实验箱大鼠Dox药物诱导，结果发现，特异性地敲低B实验箱大鼠PL印记细胞群中cbp基因后，其木僵行为降低（图3I,J）。

图3 敲低PL印记细胞群中cbp记忆可导致远期记忆受损

接下来，研究人员借助CRISPR-SaCas9系统研究dCA1-PL通路参与记忆行为。作者在大鼠海马dCA1区注射AAV1-hSyn-Cre-P2A-GFP，并在PL区注射AAV9–c-fos–rtTA-U6-gRNA和AAV9-TRE-DIO-SaCas9的混合病毒（图4A）。病毒注射三周后，借助CFC行为学范式发现，部分PL印记细胞群接受dCA1直接投射，同时，大鼠木僵行为明显降低（图4B-E）。这些数据提示了，借助CRISPR-SaCas9系统和活动依赖性细胞标记技术，可以特异性敲低dCA1-PL通路上突触后印记细胞群中cbp基因，进而抑制大鼠的远期记忆，证明接受dCA1直接投射的PL印记细胞群参与了远期记忆的维持。

图4 dCA1直接投射的PL印记细胞群参与了远期记忆的维持

借助CRISPR-SaCas9系统特异性敲低IL-Amy通路上突触前神经元cbp基因抑制大鼠恐惧记忆的消退

基于上述结果，研究人员进一步研究在相关突触前神经元中敲除cbp基因对记忆行为的影响。有研究报道，内侧前额叶皮层（mPFC）中的PL参与条件性恐惧记忆，而边缘下皮层（IL）对杏仁核（amygdala, Amy）的投射通路参与恐惧记忆消退[文献4-6]。因此，研究人员在IL区注射AAV9–c-fos–rtTA-U6-gRNA和AAV9-TRE3G-SaCas9混合病毒（图5A），行为学试验结果显示，IL c-fos阳性细胞数明显增多（图5C-D），同时，借助CRISPR-SaCas9系统特异性敲除大鼠IL神经元cbp基因，导致大鼠恐惧记忆消退受损（图5E）。

随后，研究人员将逆行病毒载体（rAAV2/retro-hSyn-mCherry）注射在Amy，以标记投射到Amy的IL神经元，行为学实验后观察到c-fos阳性细胞数明显增多，且部分接受IL投射的Amy神经元与c-fos共标，提示了IL-Amy通路在恐惧消退行为过程中被激活（图5F,G）。

接下来，研究人员在Amy注射rAAV2/retro-hSyn-Cre-P2A-GFP病毒，同时在IL注射AAV9–c-fos–rtTA-U6-gRNA-mix和AAV9-TRE3G-DIO-SaCas9病毒（图5H），借助恐惧记忆消退行为学范式发现，特异性敲低IL-Amy通路上突触前神经元cbp基因，成功抑制大鼠恐惧记忆的消退（图5I-K）。

图5 借助CRISPR-SaCas9系统特异性敲低IL-Amy通路上突触前神经元cbp基因抑制大鼠恐惧记忆的消退

最后，考虑到CRISPR-SaCas9系统的脱靶性，研究人员借助荧光激活细胞分选技术（FACS）和高通量测序，在单细胞水平上验证了SaCas9的基因编辑效率，并证实了SaCas9在体内具有很低的脱靶率（图6）。

图6 CRISPR-SaCas9系统在体内具有良好的靶向特异性

结论

本文基于CRISPR-SaCas9技术，结合AAV顺/逆行标记、活动依赖性细胞标记技术、行为学、电生理等技术手段，在实验大鼠脑部实现了通路特异性和功能特异性的基因编辑，并成功地对特定记忆进行精确操控。为解析大脑的高级认知功能提供了有力的策略，同时也为慢性痛、药物成瘾、创伤后应激综合征等这些以“病理性记忆”为特征的疾病治疗提供新思路。

和元上海有幸提供实验中使用的大量慢病毒（lenti）和腺相关病毒（AAV）病毒载体，用实际行动助力中国脑科学的发展。

客户文章回顾

●【Nat. Commun.】中山大学信文君教授团队最新研究发现CircAnks1a参与调控神经病理性疼痛的新机制

OBiO

和元上海一直致力为神经科学研究提供整体研究方案，从标记、示踪、基因操作、生理操作到观察，提供病毒包装、动物模型构建、病理研究等一站式服务。用实际行动助力中国脑科学的发展！

参考文献：

[1] Haojie Sun, et al., Development of a CRISPR-SaCas9 system for projection- and function-specific gene editing in the rat brain. Sci Adv. DOI: 10.1126/sciadv.aay6687

[2] T. Kitamura, et al., Engrams and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science 356, 73–78 (2017).

[3] S. A. Josselyn, et al., Finding the engram. Nat. Rev. Neurosci. 16,521–534 (2015).

[4] O. Bukalo, et al., Prefrontal inputs to the amygdala instruct fear extinction memory formation. Sci. Adv. 1, e1500251 (2015).

[5] F. H. Do-Monte, et al., Revisiting the role of infralimbic cortex in fear extinction with optogenetics. J. Neurosci. 35, 3607–3615 (2015).

[6] D. Sierra-Mercado, et al., Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacol. 36, 529–538 (2011).